李博安教授團隊開(kāi)發基于RAA-CRISPR/Cas12b的一(yī)步法核酸快檢技術

百日咳是一(yī)種由百日咳杆菌引起的急性呼吸道感染，早期診斷對于百日咳的治療至關重要。目前，實驗室診斷百日咳常用的方法有:培養法、直接熒光抗體(tǐ)檢測、聚合酶鏈反應(PCR)、配對及單一(yī)血清學技術。通過培養分(fēn)離(lí)百日咳杆菌是診斷百日咳的傳統“金标準”，具有大(dà)約100%的特異性。然而，基于培養的方法的靈敏度很差，在12% ~ 60%之間，而且這些方法非常耗時，平均需要5天。

傳統的PCR或逆轉錄PCR (RT-PCR)方法是核酸檢測的金标準，自20世紀90年代以來，PCR已被用作臨床和非臨床研究環境中(zhōng)百日咳的診斷工(gōng)具。然而，PCR技術需要專業的人員(yuán)和設備基礎設施，并且從采樣到結果的時間也很長，不适合簡單快速的即時檢測(POC)。核酸等溫檢測技術，如重組酶聚合酶擴增(RPA)、重組酶輔助擴增(RAA)和環介導等溫擴增(LAMP)等，具有操作簡單、恒溫、快速等優點，在POC中(zhōng)具有很大(dà)的潛力。令人沮喪的是，它們的應用受到限制，因爲與qPCR相比，它們的靈敏度較低，而且可能出現假陽性結果。

近年來，基于CRISPR/Cas的核酸檢測方法已廣泛運用于分(fēn)子診斷。将CRISPR/Cas核酸酶蛋白(bái)與等溫擴增技術相結合，開(kāi)發了一(yī)系列不需要特殊精密儀器的簡單、快速、靈敏、可視化的核酸檢測方法。例如，基于Cas13a或Cas13b的SHERLOCK核酸檢測平台，基于Cas12a的DETECTR檢測技術，以及基于Cas12b的CDetection的檢測方法可以實現核酸的快速檢測。然而，這些方法需要兩個步驟，首先擴增目标序列，然後進行CRISPR檢測。這樣的多個處理步驟增加了操作時間和交叉污染的風險。

STOPCovid (SHERLOCK Testing in One Pot)和STOPCovid v2在開(kāi)發耐熱型嗜酸芽孢杆菌Cas12b (AapCas12b)的基礎上，設計了RT-LAMP來解決兩步法的問題。但是，這些基于LAMP的一(yī)鍋檢測需要較長的反應時間，反應溫度爲60℃，這限制了LAMP的引物(wù)設計，而且溫度高容易造成燒傷，不适合在家庭等場所進行檢測。李博安團隊在之前的研究中(zhōng)發現，CRISPR-Cas蛋白(bái)的低順式裂解活性和高反式裂解活性是結合核酸擴增一(yī)步檢測的關鍵，開(kāi)發了一(yī)種不受PAM限制的一(yī)步法核酸檢測技術。近期，研究團隊發現在較低溫度下(xià)，AacCas12b仍保持較高的反式裂解活性，而順式裂解活性極弱，在此基礎上建立了RAA-CRISPR/Cas12b單鍋檢測(Rcod)系統。該研究成果以題爲“Rapid and sensitive detection of nucleic acids using an RAA-CRISPR/Cas12b one-pot detection assay (Rcod)”的研究論文在線發表于Talanta。

該研究發現AacCas12b在30◦C~39◦C溫度範圍内仍然具有較高的反式裂解活性，和較低的順式裂解活性，使得AacCas12b和較低溫度的等溫擴增（如RAA）建立一(yī)鍋法成爲可能。在Rcod體(tǐ)系中(zhōng)，AacCas12b的裂解和等溫擴增同時發生(shēng)在一(yī)個試管中(zhōng)，具有高反式裂解活性和低順式裂解活性的AacCas12b對體(tǐ)系中(zhōng)核酸的幹擾弱于具有高順式裂解活性的AacCas12b，展現出較高的靈敏度和可靠性。

與傳統的基于CRISPR的檢測方法相比，直接在一(yī)管中(zhōng)進行RAA擴增和AacCas12b切割的系統更方便實現，避免了兩步法的繁瑣操作。與其他Cas12b一(yī)步檢測方法相比，Rcod系統具有靈敏度高(0.2 copies/μL)、耗時短(30 min以内)的優點。與實時熒光定量PCR相比，Rcod聯合無核酸提取法在30 min内對221份臨床标本進行百日咳檢測，靈敏度爲97.96%，特異性爲99.19%，準确率爲98.64%。總之，Rcod系統是一(yī)種一(yī)步、簡單、快速的核酸檢測方法，具有較高的靈敏度和特異性，爲POC的診斷提供了一(yī)種快速的診斷方法。

該論文的第一(yī)作者爲廈門大(dà)學生(shēng)命科學學院博士生(shēng)林康鳳，國家兒童醫學中(zhōng)心姚開(kāi)虎教授以及廈門大(dà)學生(shēng)命科學學院碩士生(shēng)李箫和李清涵爲本文的共同第一(yī)作者，廈門大(dà)學生(shēng)命科學學院李博安教授、廈門大(dà)學醫學院李志(zhì)勇教授和廈門大(dà)學醫學院楊曉慶教授爲該文章的共同通訊作者。